Jurnal f Plant Prtectin Vl. 5, N. 3, Fall 011, P. 50-57 نشريه حفاظت گياهان (علوم و صنايع كشاورزي) جلد 5 شماره 3 پاييز 1390 ص 50-57. بررسي ويروس موزاي يك معمولي لوبيا (BCMV) در چند استان كشور و واكنش سه ژنوتيپ لوبيا به آن 4 3 *1 مهتاب پيمبري - مينا كوهي حبيبي - غلامحسين مصاحبي - كرامت اله ايزدپناه تاريخ دريافت: 1389/3/31 تاريخ پذيرش: 1390/8/3 چكيده طي دو فصل زراعي 1383 و 1384 تعداد 60 نمونه برگ لوبيا با علاي م موزاي يك رگبرگ نواري و قاشقي شدن برگ ها از مزارع استانهاي فارس كهگيلويه و بوير احمد اصفهان و تهران جمع آوري گرديد. با انجام آزمون سرولوژيكي ELISA با استفاده از آنتي سرم BCMV آلودگي 110 نمونه به اين ويروس تاي يد گرديد. واكنش سه ژنوتيپ ks-1478 (لوبيا چيتي) ks-31170 (لوبيا قرمز) و ks-4135 (لوبيا سفيد) نسبت به BCMV با مايه زني آنها با جدايه BCMV فارس مورد بررسي قرار گرفت. 10-15 روز پس از مايه زني بوته ها با استفاده از آزمون ELISA مورد بررسي قرار گرفتند. نتايج به دست آمده بيانگر %65/4 آلودگي در ژنوتيپ چيتي %58/1 آلودگي در ژنوتيپ قرمز و %3/6 آلودگي در ژنوتيپ سفيد بود. از ژنوتيپهاي لوبيا قرمز و چيتي مايه زني شده تعداد 5 گياه و از ژنوتيپ لوبيا سفيد تعداد 35 گياه انتخاب شده در آزمون RT-PCR و IC-RT-PCR با استفاده از آغازگرهاي اختصاصي BCMV مورد آزمايش قرار گرفتند. نتايج بيانگر تكثير قطعه اي به طول 890 جفت باز در گياهان اليزا مثبت ژنوتيپهاي قرمز و چيتي و تعداد محدودي از گياهان اليزا منفي بود. نتيجه آزمون RT-PCR و IC-RT-PCR در 5 بوته از ژنوتيپ لوبيا سفيد كه فاقد علاي م بوده و نتايج آزمون اليزا در مورد آنها منفي بود نيز مثبت ارزيابي گرديد. بذور بوتههاي لوبيايي كه در شرايط گلخانه آلوده شده بودند جمع آوري و در شرايط گلخانه مجددا كشت شدند. بوتههاي حاصل از كاشت بذور ژنوتيپهاي چيتي قرمز و سفيد در مرحله دو برگي جهت تعيين ميزان بذرزاد شدن BCMV با استفاده از آزمونهاي DAS-ELISA و IC-RT-PCR مورد بررسي قرار گرفتند. ميزان انتقال با بذر در ژنوتيپهاي چيتي (ks-1478) قرمز( ks-31170 ) و سفيد (ks-4135) به ترتيب 79/8 78/3 و 54/9 درصد برآورد گرديد. واژه هاي كليدي: BCMV ژنوتيپ هاي لوبيا بذرزادي IC-RT-PCR مقدمه 1 حبوبات پس از غلات مهمترين منبع غذايي بشر بوده و از اين بين لوبيا يكي از مهمترين حبوبات جهان محسوب مي شود. لوبيا با نامهاي انگليسي Cmmn Bean,Dry Bean,Bean و نام علمي L. Phaselus vulgaris از خانواده Fabaceae (Leguminsae) و زير تيره Papilinidae بوده و داراي 5 گونه زراعي و حدود 50 گونه وحشي مي باشد. گونه.P vulgaris شامل واريته هاي لوبيا سبز و لوبيا خشك (چيتي سفيد قرمز و كرم) مي باشد كه لوبياهاي مورد كشت در ايران نيز از واريتههاي مختلف 1 و 3- به ترتيب كارشناس ارشد استاديار و دانشيار گروه گياهپزشكي دانشكده علوم و مهندسي كشاورزي پرديس كشاورزي و منابع طبيعي دانشگاه تهران (Email: peyambari@ut.ac.ir (*- نويسنده مسي ول: 4- استاد گروه گياهپزشكي دانشكده كشاورزي دانشگاه شيراز اين گونه هستند (4). بيشترين سطح زير كشت لوبيا در ايران مربوط به واريته نوع چيتي است (1). واريته هاي مختلف لوبيا ميزبان طبيعي تعداد زيادي از ويروس هاي بيمارگر گياهي بوده و در بين آنها ويروس موزاي يك معمولي لوبيا (Bean cmmn msaic (Ptyvirus) متعلق به گروه پوتي ويروس ها virus, BCMV) يكي از شايع ترين و مخربترين انواع آنها است. اين ويروس در طبيعت دامنه ميزباني وسيعي نداشته و عمدتا گونه هاي جنس Phaselus به ويژه گونه.P vulgaris را آلوده مي نمايد. BCMV در طبيعت توسط بذر و شتههاي ناقل نظير Aphis craccivra, Aphis fabae, Myzus persicae, Acyrthsiphn pisum به صورت ناپايا و در آزمايشگاه از طريق مايه زني مكانيكي منتقل مي گردد (10). اين ويروس معمولا روي ارقام لوبيا علاي م موزاي يك ايجاد مي نمايد. اما برخي از استرين هاي آن روي ارقام حساس و در درجه حرارتهاي بالا نكروز سيستميك كشنده (Lethal systemic
چ( بررسي ويروس موزاي يك معمولي لوبيا... 51 necrsis) ايجاد مي نمايند (15). طبق مطالعات انجام گرفته نوع علايم ايجاد شده توسط اين ويروس روي ارقام لوبيا به تعامل بين ژنهاي مقاومت ميزبان گياهي و ژنهاي بيماري زاي ويروس 0 P1, P1, P, ) BCMV بستگي دارد.(10) مقاومت به ( P, P در ارقام مختلف لوبيا توسط چندين ژن تعيين مي گردد (9 و 10) اين گروه از ژنها به دو دسته ژنهاي استرين اختصاصي و ژنهاي استرين غيراختصاصي قابل تفكيك هستند. ژنهاي استرين غير اختصاصي غالب و مغلوب به ترتيب ژن I و ژن bc-u مي باشند. تمامي ژنهاي استرين اختصاصي bc-3) (bc-1, bc-1, bc-, bc-, مغلوب هستند (1). در غياب ژن I حضور ژن bc-u جهت بيان تمام ژنهاي مقاومت استرين اختصاصي مغلوب ضروري است. ژن استرين غير اختصاصي غالب I به عنوان ژن ممانعت كننده تمام سويه هاي شناخته شده اين ويروس شناسايي شده است. ژن غالب I روي رنگ پوسته بذور ارقام لوبيا اثر گذاشته و باعث تيره گي رنگ آنها مي شود (1). ژن غالب I در بافتهاي گياهي تكثير ويروس را از طريق توليد فيتوالكسين فازي ولين (كه از طريق مسير بيوسنتز فنيل پروپانوي يد توليد مي شود) كنترل مي كند. چنين واكنش فوق حساسيتي به صورت نكروز انتهايي سيستميك در هر دو حالت مقاومت و حساسيت ديده مي شود. مرگ انتهايي گياه و حركت فازي ولين از طريق سيستم آوندي به طرف قسمتهاي پايين گياه موجب تغيير رنگ بافت آوندي و در نتيجه موجب مرگ گياه مي شود. اين واكنش سياهي ريشه (black- rt) نام دارد. يك ارتباط ژن براي ژن بين ژن هاي مقاومت استرين اختصاصي ) bc- (bc-1-, bc-1, bc-, با ژنهاي بيماري زايي ويروس با 1 P, P, P, P كدهاي مشابه ) ( 1 يافت شده است. بر اساس اين تي وري هر ژن مقاومت ميزبان كه براي يك سويه ويروس اختصاصي محسوب مي شود اگر سويه ويروس آلوده كننده حاوي ژنهاي بيماري زايي مناسب باشد مي تواند مغلوب شود. تاكنون براي ژن مقاومت bc-3 هيچ ژن بيماري زايي مشابهي شناخته نشده است و ژنوتيپهاي لوبيا كه داراي اين ژن مقاومت هستند در برابر تمام سويه هاي شناخته شده BCMNV و P مي باشند. سويه هاي داراي ژن بيماري زايي BCMVمقاوم ميتوانند تنها ژنوتيپ هايي از لوبيا را آلوده كنند كه ژن مقاومت نداشته باشند (9 و 10). معمولا براي كنترل بيماري حاصل از BCMV استفاده از بذور عاري از ويروس و هچنين كاربرد ارقام مقاوم توصيه مي گردد. در ايران تاكنون مطالعات متعددي در زمينه تشخيص اين ويروس و بررسي ويژگيهاي BCMV انجام گرفته ( 6 5 3 و 7) اما براساس بررسيهاي انجام گرفته تاكنون مطالعاتي در زمينه آگاهي از فراواني ويروس در مزارع مختلف و واكنش ارقام مختلف لوبيا نسبت به آن اطلاعاتي منتشر نشده است. در اين تحقيق نقش BCMV در ايجاد موزاي يك لوبيا در چند استان كشور و واكنش سه ژنوتيپ لوبيا نسبت به آن مورد ارزيابي قرار گرفته است. مواد و روش ها نمونه برداري و ارزيابي نمونه هاي جمع آوري شده در طي سالهاي 1383 و 1384 نمونه برداري از مزارع لوبياي مناطق مختلف استان هاي فارس كهگيلويه و بوير احمد تهران و اصفهان صورت گرفت. نمونههاي گياهي آلوده در مزارع لوبيا مورد بازديد بر اساس علايم ذكر شده در منابع شامل موزاي يك شديد و يا خفيف قاشقي شدن برگها رگبرگ نواري و پيچيدگي برگ انتخاب شدند. در نهايت تعداد 60 نمونه گياهي داراي علاي م مذكور از مناطق مختلف جمع آوري و در آزمايشگاه با استفاده از آنتي سرم چند همسانه اي (DSMZ, Germany) BCMV در آزمون ELISA مورد بررسي قرار گرفتند (8 و 11). مايه زني ژنوتيپهاي مورد بررسي لوبيا در شرايط گلخانه براي آگاهي از درصد بذرزادي ويروس پس از انجام آزمون ELISA يكي از جدايههاي BCMV از استان فارس كه نسبت به ساير جدايه ها ميزان جذب بالاتري در اين آزمون داشت پس از خالص سازي بيولوژيكي روي گياه لوبيا رقم Buntiful به گياهان C. amaranticlr Chenpdium quina و لوبيا (ارقام Buntiful وkidney (Red مايه زني شد و در شرايط گلخانه تكثير گرديد. از اين جدايه جهت انجام آزمونهاي بعدي به منظور بررسي خاصيت بذرزادي ويروس استفاده شد. عصاره بوتههاي تلقيح شده و آلوده رقم Buntiful لوبيا با استفاده از بافر فسفات پتاسيم 0/01 مولار (7 (ph تهيه شد و روي 55 بوته از هر سه ژنوتيپ لوبيا ks-1478 يتي) ks-31170 (قرمز) و ks-4135 (سفيد) تهيه شده از ايستگاه تحقيقاتي خمين استان مركزي به روش مكانيكي مايه زني گرديد. پنج بوته نيز از هر ژنوتيپ لوبيا به عنوان شاهد منفي با استفاده از بافر مذكور مايه زني گرديدند. بررسي ميزان آلودگي ژنوتيپ هاي لوبيا مدت 10-15 روز پس از مايه زني ژنوتيپ هاي تلقيح شده لوبيا با استفاده از آزمونهاي ELISA و IC-RT-PCR از نظر ميزان آلودگي به BCMV مورد بررسي قرار گرفتند (14). پليتهاي ELISA با استفاده از دستگاه ELISA-reader بررسي و
5 نشريه حفاظت گياهان (علوم و صنايع كشاورزي) جلد 5 شماره 3 پاييز 1390 نمونههايي از گياهان تلقيح شده به عنوان آلوده در نظر گرفته شدند كه ميزان عددي جذب نوري آنها در طول موج 405 نانومتر مساوي و يا بيشتر از دو برابر جذب نمونههاي شاهد منفي اندازه گيري شده بودند. همچنين به منظور شناسايي دقيق تر ويروس در نمونههاي آلوده از گياهان تلقيح شده لوبيا يك جفت آغازگر اختصاصي BCMV بر اساس بخش N -ترمينال توالي نوكلي وتيدي پروتي ين پوششي ويروس (CP) و بخشي از توالي نوكلي وتيدي NIb با استفاده از نرم افزار IC-RT- و يا RT-PCR طراحي شد كه در طي Vectr NTI PCR قطعه اي به طول 890 جفت باز را تكثير مي نمايد. آغازگرهاي مورد استفاده در اين تحقيق در واكنش RT-PCR و IC-RT- شامل Dnl3 PCR (GAATTGAAAGCGTACTATCTAATACAG) وUnl3 CAGCTTGAATTTGATTCTGATGATGAGGTG) ( بودند. واكنش هاي RT-PCR در دستگاه ترموسايكلر Palm Crbett Research ساخت كمپاني مدل GP001 Cycler استراليا انجام گرفت. اجزاي مخلوط واكنش 4µl RT-buffer ) RT بافر 1x TBE با استفاده از الكتروفورز تفكيك گرديد و اندازه تقريبي قطعه تكثير شده با استفاده از نشانگر DNA يك كيلو جفت بازي (1kbp) تعيين شد. همچنين جهت اطمينان از عدم آلودگي نمونههاي تلقيح شده ژنوتيپهاي مختلف لوبيا به BCMNV آزمون IC-RT-PCR با استفاده از يك جفت آغازگر اختصاصي اين ويروس طراحي شده توسط (1996) Xu & Hamptn كه قطعه اي به طول 9 جفت باز را تكثير مي نمايد و آنتي سرم چند همسانه اي اين ويروس Germany) (DSMZ, انجام گرديد. واكنش RT جهت توليد cdna به مدت يك ساعت در دماي 4 درجه سانتي گراد و آزمون PCR با واسرشت سازي اوليه در دماي 94 درجه سانتي گراد به مدت سه دقيقه و تعداد 35 چرخه آزمون PCR با واسرشت سازي در دماي 94 درجه سانتيگراد به مدت يك دقيقه اتصال آغازگرها در دماي 43 درجه سانتي گراد به مدت يك دقيقه بسط زنجيره در دماي 7 درجه سانتي گراد به مدت يك دقيقه و بسط نهايي زنجيره در دماي 7 درجه سانتي گراد به مدت 10 دقيقه انجام گرديد. كاشت بذور حاصل از ژنوتيپهاي لوبيا چيتي قرمز و سفيد مايه زني شده با BCMV جهت تعيين درصد بذرزادي ژنوتيپهاي مختلف گياهان لوبياي مايه زني شده با BCMV جهت تعيين ميزان بذرزادي اين ويروس در اين ژنوتيپ ها تا مرحله بذردهي در گلخانه نگهداري شدند. با استفاده از سيستم خنك كننده و دستگاه گرمادهي موجود سعي گرديد در طول تابستان و زمستان دماي گلخانه همواره بين -5 30 C حفظ شود. همچنين شدت نور با استفاده از حصيرهاي موجود بر روي سقف شيشه اي گلخانه تنظيم گرديد. جهت كنترل شته كنه و مگس سفيد سمپاشي با سموم مناسب صورت گرفت. تمامي بذور حاصل از اين گياهان (لوبيا چيتي 83 بذر لوبيا قرمز 114 بذر و لوبيا سفيد 16 بذر) جمع آوري و با شرايط ذكر شده در فوق در گلخانه كاشته شدند. در مرحله دو برگي گياهچه ها بوته ها از لحاظ علايم ظاهري بررسي شدند و همچنين با استفاده از آزمونهاي DAS-ELISAو IC-RT-PCR جهت آلودگي به ويروس مورد بررسي قرار گرفتند. نتايج و بحث ارزيابي نمونه هاي گياهي جمع آوري شده و علاي م ناشي از مايه زني ويروس روي گياهان محك از بين 60 نمونه گياه لوبياي مشكوك به آلودگي جمع آوري شده از مزارع مختلف استانهاي مذكور با استفاده از آزمون 1µl f 10mM 1µl f 100mM DTT 7µl HO 5x 0.5µl f 40u/μl RNase inhibitr enzyme dntps 1µl f 0.5µl f 00u/μl MMLV-RT enzyme (5µl RNA 100pM reverse primer; DBCMV با يكديگر تركيب شده و واكنش RT جهت توليد cdna به مدت يك ساعت در دماي 4 درجه سانتي گراد انجام گرديد. RNA مورد نياز جهت انجام واكنش با استفاده از كيت RNeasy شركت كياژن از بافت گياهي استخراج گرديد. جهت انجام IC-RT-PCR نيز از آنتيبادي چند همسانه اي (DSMZ, Germany) BCMV استفاده شد. سپس اجزاي مخلوط واكنش.5µl PCR-) PCR 0.5µl 1µl f 50mM MgCl 14.6µl H O buffer 10x 0.6µl f 100pM frward primer; f 10mM dntps 0.5µl f 100pM reverse primer; UBCMV 0.3µl f 5u/μl Taq 5µl cdna DBCMV (plymerase تركيب شده و آزمون PCR با واسرشت سازي اوليه در دماي 94 درجه سانتي گراد به مدت سه دقيقه و تعداد 35 چرخه آزمون PCR با واسرشت سازي در دماي 94 درجه سانتيگراد به مدت يك دقيقه اتصال آغازگرها در دماي 48 درجه سانتي گراد به مدت يك دقيقه بسط زنجيره در دماي 7 درجه سانتي گراد به مدت يك دقيقه و بسط نهايي زنجيره در دماي 7 درجه سانتي گراد به مدت 10 دقيقه انجام گرديد. محصول نهايي حاصل از RT-PCR در ژل آگاروز %1 در
بررسي ويروس موزاي يك معمولي لوبيا... 53 سرولوژيكي ELISA آلودگي تعداد 110 نمونه گياهي به BCMV تاي يد گرديد (جدول 1). براساس تعداد نمونههاي گياه لوبياي آلوده درصد آلودگي مزارع نمونه برداري شده به BCMV در استانهاي فارس كهگيلويه و بوير احمد تهران و اصفهان به ترتيب %47/1 %7/7 %50 و %1 تعيين گرديد. جدايه BCMV متعلق به استان فارس روي گياهان محك.C quina و.C amaranticlr علاي م ظاهري قابل تشخيص ايجاد نكرد. اما جدايه ويروس انتخاب شده روي دو رقم لوبيا kidney) (Buntiful & Red علاي م ظاهري نظير موزاي يك پيچيدگي و باريك شدن برگها و رگبرگ نواري را ايجاد نمود. بررسي علاي م و ميزان آلودگي ژنوتيپ هاي لوبياي مايه زني شده با BCMV جدايه منتخب BCMV از استان فارس در دماهاي كمتر از 30 C روي ژنوتيپهاي لوبيا چيتي و قرمز علاي مي نظير موزاي يك قاشقي شدن برگ و رگبرگ نواري ايجاد نمود (شكل 1 و ). اما اين جدايه از ويروس در دماي 30 C و دماهاي بالاتر از آن در برگهاي مايه زني شده ژنوتيپهاي لوبيا چيتي و قرمز ايجاد نكروز رگبرگ نمود (شكل 3). هيچيك از 55 بوته متعلق به ژنوتيپ لوبيا سفيد مايه زني شده با جدايه BCMV از استان فارس علايم قابل مشاهده اي را نشان ندادند. همچنين بوته هايي از گياهان لوبيا متعلق به هر سه ژنوتيپ كه به عنوان شاهد با استفاده از بافر فسفات مايه زني شده بودند فاقد علاي م ظاهري قابل تشخيص بودند. براساس نتايج حاصل از آزمون اليزا درصد آلودگي به BCMV در ژنوتيپ چيتي % 65/4 ژنوتيپ قرمز % 58/1 و ژنوتيپ سفيد % 3/6 به BCMV تعيين گرديد (جدول ). به علت فقدان علاي م قابل مشاهده در بوتههاي ژنوتيپ لوبيا سفيد و عدم رديابي ويروس توسط آزمون ELISA در اين بوته ها جهت اطمينان از حضور و يا عدم حضور ويروس در آنها و همچنين اطمينان از نتايج اليزا در بوتههاي ژنوتيپھ ای لوبيا قرمز و چيتي تعداد 35 بوته از ژنوتيپ لوبيا سفيد و 5 بوته از هر كدام از ژنوتيپهاي لوبيا قرمز و چيتي جهت بررسي توسط آزمون RT- PCR و يا IC-RT-PCR انتخاب شدند. در مورد لوبيا قرمز و چيتي نيمي از گياهان اليزا مثبت و نيمي ديگر اليزا منفي بودند و يك بوته نيز از گياهان شاهد انتخاب گرديد. اما در مورد لوبيا سفيد چون تنها دو بوته اليزا مثبت بودند بنابراين 3 بوته ديگر از بين گياهان اليزا منفي و يك بوته نيز از گياهان شاهد انتخاب گرديدند. آزمون IC-RT-PCR با استفاده از آغازگر اختصاصي BCMV انجام گرديد كه نتايج آن حاكي از وجود اين ويروس در تمامي بوتههاي ژنوتيپهاي لوبيا قرمز و چيتي اليزا مثبت بود و در تعدادي از گياهان اليزا منفي نيز باند مورد نظر تكثير گرديد. جدول 1- مناطق نمونه برداري شده تعداد كل نمونههاي گياهي جمع آوري شده و تعداد نمونههاي آلوده بهBCMV مناطق نمونه برداري (استان) فارس اصفهان كهگيلويه و بويراحمد تهران تعداد نمونههاي گياهي جمع آوري شده 197 5 16 تعداد نمونههاي آلوده بهBCMV 93 3 6 8 درصد آلودگي نمونهھای جمع آوري شده %47/1 %1 %7/7 %50 110 60 مجموع a b c شكل 1- علاي م آلودگي به BCMV در ژنوتيپ ks-1478 (لوبيا چيتي) در دماهاي كمتر از 30 C a) قاشقي شدن برگ b) موزاي يك c) رگبرگ نواري
54 نشريه حفاظت گياهان (علوم و صنايع كشاورزي) جلد 5 شماره 3 پاييز 1390 a b رقم لوبيا چيتي قرمز سفيد شكل - علاي م آلودگي به BCMV در ژنوتيپ ks-31170 (لوبيا قرمز) در دماهاي كمتر ازC 30 a) لكه هاي كلروتيك b) موزاي يك و پيچيدگي برگ. جدول - تعداد بوتههاي آلوده سه ژنوتيپ مورد بررسي لوبيا به BCMV براساس آزمون اليزا تعداد بوتههاي كاشته شده از هر ژنوتيپ لوبيا تعداد بوتههاي مايه زني شده با BCMV تعداد بوتههاي شاهد تعداد بوتههاي آلوده براساس درصد آلودگي 65/4 58/1 3/6 آزمون ELISA 36 3 5 5 5 55 55 55 60 60 60 به BCMV در مرحله دو برگي از لحاظ علاي م ظاهري و همچنين با استفاده از آزمون هاي ELISA و IC-RT-PCR مورد بررسي قرار گرفتند. بوتههاي لوبيا چيتي حاصل از بذور بوتههاي آلوده به BCMV علايمي نظير موزاي يك قاشقي شدن برگها رگبرگ نواري و گاهي نكروز موضعي (شكل 5) را از خود نشان دادند. علايم آلودگي در بوتههاي لوبيا قرمز حاصل از بذور بوتههاي آلوده به BCMV به صورت موزاي يك و رگبرگ نواري مشاهده گرديد (شكل 5). بوتههاي لوبيا سفيد حاصل از كشت بذور بوتهھای آلوده بهBCMV فاقد هر نوع علايم ظاهري قابل مشاهده اي بودند (شكل 6). بررسي بذور آلوده نشان داد كه ژنوتيپهاي لوبيا چيتي با % 78/3 بذرزادي بيشترين ميزان و لوبيا سفيد با % 54/9 بذرزادي كمترين ميزان بذرزادي را نسبت به ويروس BCMV دارا مي باشند (جدول 3). اما در بيش از نيمي از بوتههاي لوبيا سفيد (5 بوته) مورد آزمايش حتي در بوته هايي كه آزمون اليزا موفق به شناسايي آنها نگرديده بود اين آزمون وجود ويروس را مشخص نمود و باند مورد نظر تشكيل گرديد. در هيچ كدام از گياهان شاهد ژنوتيپهاي مورد بررسي در اين آزمون باندي مشاهده نشد. ارزيابي محصول آزمون IC-RT-PCR از طريق الكتروفورز افقي در ژل آگاروز %1 و تشكيل باند مورد انتظار نشان دهنده تكثير قطعه اي از ژنوم ويروس به طول 890 جفت باز بود. آغازگرهاي اختصاصي BCMNV در طي آزمون IC-RT-PCR قادر به تكثير هيچ قطعه اي متعلق به ژنوم ويروس نبود كه نشان دهنده عدم آلودگي بوتههاي مورد آزمايش ژنوتيپهاي مختلف لوبيا به اين ويروس مي باشد (شكل 4). بررسي انتقال ويروس در ژنوتيپهاي لوبيا چيتي قرمز و سفيد از طريق بذر بوتههاي لوبيا چيتي قرمز و سفيد حاصل از بذور بوتههاي آلوده a b شكل - 3 علاي م آلودگي به BCMV در ژنوتيپ هاي ks-31170 (لوبيا قرمز) و ks-1478 (لوبيا چيتي) در دماهاي بيشتر از 30 C a) نكروز رگبرگ در لوبيا چيتي b) نكروز رگبرگ در لوبيا قرمز
بررسي ويروس موزاي يك معمولي لوبيا... 55 F B B T M 890 bp شكل - 4 نتايج آزمون IC-RT-PCR با استفاده از جفت آغازگر اختصاصي BCMV (M BCMNV (T BCMV (B ماركر رقم لوبيا چيتي قرمز سفيد تعداد بذوركاشته شده / تعداد بوته حاصل / تعداد بوته داراي علاي م بيماري 83/65/57 114/91/75 16/89/0 جدول 3- آلودگي بذري سه ژنوتيپ لوبيا به جدايه BCMV از استان فارس تعداد بوتههاي آزمايش شده با روش / ELISA تعداد بوتههاي داراي آلودگي به ويروس 65/46 91/68 89/3 تعداد بوتههاي آزمايش شده با روش IC-RT- / PCR تعداد بوتههاي داراي آلودگي به ويروس 3/5 34/7 4/3 a b 355 45 116 18.4 شكل 5- a) نكروز موضعي در لوبيا چيتي حاصل از بذور آلوده به BCMV در دماي بالاتر از 30 C BCMV موزاي يك در لوبيا قرمز آلوده به b) شكل - 6 بوتههاي لوبيا سفيد حاصل از بذور آلوده به BCMV بدون علاي م قابل مشاهده
56 نشريه حفاظت گياهان (علوم و صنايع كشاورزي) جلد 5 شماره 3 پاييز 1390 بحث با توجه به تحقيقاتي كه تاكنون در نقاط مختلف دنيا صورت گرفته است مشخص گرديده است كه ويروس BCMV مهمترين و شايع ترين ويروس لوبيا بوده و بذرزاد نيز مي باشد (1). لذا بررسي ميزان شيوع و تعيين درصد بذرزاد شدن آن جهت ايجاد روشهاي مناسب براي مديريت بيماري حاصل از اين ويروس در مزارع لوبيا از اهميت به سزايي برخوردار است. نتايج حاصل از بررسي نمونههاي گياهي آلوده جمع آوري شده از چهار استان مختلف ايران نشان داد كه BCMV عامل اصلي ايجاد كننده علاي م موزاي يك لوبيا در اين استان ها مي باشد. اين نتايج با يافتههاي بهرامي كمانگر (3) و هاشمي (7) مطابقت دارد. همچنين نتايج تحقيقات بيانگر ميزان آلودگي بيشتر در مزارع لوبياي استان فارس بود. پس از اين استان از نظر درصد آلودگي به ترتيب استانهاي كهگيلويه و بويراحمد تهران و اصفهان قرار داشتند. از آنجا كه استان فارس يكي از مهمترين مناطق كشت لوبيا مي باشد (1) بررسي گسترده در اين استان و تعيين جدايه غالب BCMV در مزارع لوبياي اين استان و تلاش جهت دستيابي به ارقام متحمل در برابر اين جدايه ها اهميت ويژه اي دارد. در اين تحقيق علايم ناشي از تلقيح ويروس در گياهان لوبياي ميزبان مشابه علايم حاصل از اين ويروس بود كه توسط مصاحبي (5) برادران () بهرامي كمانگر (3) نادرپور (6) هاشمي (7) و دريجفوت (9 و 10) گزارش شده است. با اين تفاوت كه در مطالعه حاضر جدايه منتخب اين ويروس روي گياهان محك C.quina و.C amaranticlr علايم ظاهري قابل مشاهده اي ايجاد ننمود. نتايج حاصل از آزمون اليزا نيز طبق انتظار بيانگر حضور اين ويروس در غلظتهاي قابل رديابي توسط اين آزمون در ژنوتيپهاي قرمز و چيتي لوبيا بود. اما لوبيا سفيد موردي استثنايي بود كه در آن ويروس توسط آزمون اليزا قابل رديابي نبود و نياز به انجام آزمايشات تكميلي بيشتري داشت. در بررسي ژنوتيپ لوبيا سفيد با استفاده از آزمون IC-RT-PCR به كمك جفت آغازگر اختصاصيBCMV قطعه اي به طول 890 جفت باز از ژنوم ويروس تكثير گرديد كه مطابق با اندازه قطعه مورد انتظار بود. بنابراين آلودگي اين ژنوتيپ لوبيا نيز با استفاده از اين آزمون اثبات گرديد. نتايج به دست آمده نشان دادند كه ژنوتيپ ks-4135 (لوبيا سفيد) تحت شرايط گلخانه اي نسبت به BCMV متحمل و عموما فاقد علاي م ظاهري قابل مشاهده بود و نسبت به ژنوتيپهاي لوبيا چيتي و قرمز تعداد بذور بيشتري را توليد نمود و اين بذور در مقايسه با بذور توليد شده توسط ژنوتيپهاي چيتي و قرمز لوبيا داراي قدرت جوانه زني بالاتري بوده و اين بذور گياهچههاي بيشتري را نيز توليد نمودند. با توجه به تعداد بذور سالم و آلوده حاصل از گياهان تلقيح شده با ويروس درصد بذرزاد شدن BCMV نيز در اين ژنوتيپ لوبيا كمتر از سايرين بود. در تحقيقي كه توسط ميكلاس و همكاران (1997 al., (Miklas et انجام گرفته است نيز سه جرم پلاسم مقاوم از لوبياي سفيد در برابر BCMV و BCMNV شناسايي شده اند. در حالي كه ژنوتيپهاي لوبيا قرمز و چيتي نسبت به ويروس حساس بوده و ميزان توليد بذر در آنها در اثر آلودگي به ويروس كاهش يافته و همچنين قدرت جوانه زني بذور نيز نسبت به گياهان شاهد كمتر بود. لذا با توجه به اينكه ژنوتيپ لوبيا سفيد علي رغم آلودگي به ويروس علايم قابل مشاهده اي را بروز نداده و نيز كاهش كيفي و كمي محصول (بذور حاصل از گياهان آلوده) در آن قابل توجه نمي باشد بنابراين بررسي جنبههاي مختلف آلودگي اين ژنوتيپ به ويروس موزاي يك معمولي لوبيا (BCMV) مي تواند حاي ز اهميت باشد. همچنين واكنش چنين ژنوتيپي در برابر ساير جدايههاي منتخب ويروس كه شيوع و پرآزاري نسبتا زيادي در مناطق مورد مطالعه دارند نيز مي تواند در تعيين قابليت چنين ژنوتيپهاي متحملي موثر باشد. به طوريكه نتايج چنين آزمونهايي در نهايت در معرفي ژنوتيپهاي متحمل قابل اعتماد كه قابل كاربرد در مناطق داراي آلودگي زياد گياهان لوبيا به اين ويروس باشند اهميت به سزايي خواهند داشت. منابع 1- آمارنامه كشاورزي. 1383. اداره كل آمار و اطلاعات وزارت كشاورزي. تهران. - برادران غ. 1376. بررسي ويروس موزاي يك معمولي لوبيا (BCMV) و تعيين پراكنش آن در منطقه مشهد و چناران. پايان نامه كارشناسي ارشد دانشگاه مشهد 97 صفحه. 3- بهرامي كمانگر س. 1377. شناسايي و فراواني نسبي ويروسهاي مولد موزاي يك لوبيا در استان فارس. پايان نامه كارشناسي ارشد دانشگاه شيراز 4 صفحه.
بررسي ويروس موزاي يك معمولي لوبيا... 57 4- در ي ح. لك م. بني جمالي س.م. داديور م. قنبري ع. خودشناس م. و اسدي ب. 138. لوبيا (از كاشت تا برداشت). نشريه آموزشي ترويج 77 صفحه. 5- مصاحبي محمدي غ. 1351. مطالعه ويروس موزاي يك معمولي لوبيا و بررسي خواص ايزولهھ ای مختلف اين ويروس در ايران. پايان نامه كارشناسي ارشد دانشگاه تهران 185 صفحه. 6- نادرپور م. 1378. شناسايي پاتوتيپ ها و استرينهاي ويروس Bean cmmn msaic virus در استان تهران. پايان نامه كارشناسي ارشد دانشگاه تهران 11 صفحه. 7- هاشمي م. 1378. مقايسه خصوصيات سرولوژيكي بيولوژيكي و فيزيكوشيميايي پوتي ويروسهاي مولد موزاي يك معمولي لوبيا زرد لوبيا و موزاي يك بذرزاد لوبيا چشم بلبلي در فارس. پايان نامه كارشناسي ارشد دانشگاه شيراز 135 صفحه. 8-Clark M.F. and Adams A.N. 1977. Characteristics f the micrplatemethd f enzyme-linked immunsrbant assay fr the detectin f plantviruses. Jurnal f General Virlgy, 34: 475-483. 9-Drijfhut E. 1978. Genetic interactin between Phaselus vulgaris L. and bean cmmn msaic virus with implicatins fr strain identificatin and breeding fr resistance. Agricultural Research Reprt 87, Pudc, Wageningen. 10-Drijfhut E. 1991. Bean cmmn msaic. Cmpendium f Bean Diseases. APS Press, pp 37-39. 11-Kening R. 1981. Indirect ELISA methds fr the brad specificity detectin f plant viruses. Jurnal f General Virlgy, 55: 53-6. 1-Mavric I. and Sustar-Vzlic J. 004. Virus diseases and resistance t Bean cmmn msaic and Bean cmmn msaic necrsis ptyvirus in cmmn bean (Phaselus vulgaris L.). Acta agriculturae slvenica, 83: 181-190. 13-Miklas P. N., Beaver J. S., Steadman J. R., Silbernagel M. J. and Freytag G. F. 1997. Registratin f three bean cmmn msaic virus-resistant navy bean germplasms. Crp Science, 37: 105. 14-Nlasc G., Blas C., Trres V. and Pnz F. 1993. A methd cmbining immuncapture and PCR amplificatin in a micrtiter plate fr the detectin f plant viruses and subviral pathgens. Jurnal f Virlgical Methdes, 45: 01-18. 15-Silbernagel M.J., Mink G.I., Zha R-L. and Zheng G-Y. 001. Phentypic recmbinatin between bean cmmn msaic and bean cmmn msaic necrsis ptyviruses in viv. Archives f Virlgy, 146: 1007-100.